Lutter contre l'impasse diagnostique dans les maladies mitochondriales : une approche transcriptomique dans les fibroblastes et les cellules sanguines

Le séquençage nouvelle génération (NGS), et en particulier le séquençage de l'exome entier (WES) ou du génome entier (WGS), a permis une avancée technique majeure qui a considérablement amélioré le diagnostic génétique. Cependant, environ 50 % des patients restent encore sans diagnostic et se trouvent dans une impasse diagnostique. L'une des causes de cette situation réside dans les variants pathogènes qui modifient l'expression des transcrits et/ou l'épissage de l'ARN. Ces variants peuvent être situés dans des régions introniques profondes ou intergéniques, ou dans la séquence codante, qu'il s'agisse de variants synonymes ou faux-sens, ayant également des conséquences pathogènes sur l'épissage ou l'expression génique.

Il est très souvent difficile d'interpréter la pathogénicité de ces variants, qui restent souvent des variants de signification incertaine (VSI). L'utilité du séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans le diagnostic génétique des MM a été démontrée ces dernières années par plusieurs équipes, avec des rendements diagnostiques de 10 % à 35 %. Ces études sont idéalement réalisées à partir de tissu musculaire, les MM s'exprimant le plus souvent dans les tissus à métabolisme énergétique élevé tels que le muscle, le cœur, le cerveau ou le foie. Cependant, les biopsies de ces tissus étant difficiles à obtenir, la plupart des études de transcrits sont réalisées à partir de fibroblastes obtenus par biopsie cutanée.

En effet, des anomalies de régulation extrêmes telles qu'une perte d'expression ou un épissage aberrant peuvent être détectées dans les fibroblastes, même si la conséquence physiologique sur les fibroblastes peut être négligeable. Cependant, certains patients refusent également ces biopsies et peuvent rester dans une impasse diagnostique en l'absence d'analyse fonctionnelle permettant de confirmer la pathogénicité des variants identifiés. Des études d'ARN peuvent également être réalisées à partir d'ARN extrait de cellules sanguines sur tubes PAXGene.

La quantité d'ARN extraite est plus faible que celle extraite des fibroblastes, mais ce type d'analyse évite une procédure plus invasive, permet de gagner du temps technique en évitant les manipulations associées à la mise en culture cellulaire, et permet de gagner du temps pour le patient en permettant une extraction immédiate à partir du tube sanguin sans attendre la culture cellulaire. Frésard et al. ont montré, chez des patients atteints de 16 pathologies mendéliennes différentes, que le RNA-seq sur cellules sanguines permettait d'identifier un diagnostic chez 7,5 % des patients testés. Leur approche a révélé à la fois des variations d'expression et des anomalies d'épissage.

Les investigateurs proposent donc de réaliser une étude des transcrits par séquençage d'ARN à haut débit (RNA-Seq), en parallèle sur l'ARN extrait de fibroblastes et sur l'ARN extrait de cellules sanguines, chez 10 patients présentant une suspicion de maladie mitochondriale chez lesquels des variants de signification incertaine dans des gènes candidats (VSI+) ont été identifiés. Les investigateurs ont choisi de cibler notre étude sur des patients porteurs de VSI+, préalablement identifiés par NGS, afin de faciliter l'interprétation des données de RNA-Seq dans le cadre d'une étude « pilote ». Chez ces patients, porteurs de variants dans des gènes candidats, les investigateurs concentreront notre analyse bio-informatique sur ces gènes. Pour l'interprétation des VSI+, une approche ciblée par séquençage Sanger basée sur la RT-PCR, ou par quantification de l'expression génique par PCR quantitative, est également envisageable, mais nécessite un développement spécifique pour chaque variant, ce qui est très chronophage et non négligeablement coûteux. L'avantage d'une approche par RNA-seq est qu'elle homogénéise la stratégie diagnostique pour les patients, permet de gagner du temps d'analyse et donc de réduire le temps passé en errance diagnostique.