Recrutement en cours

Lutter contre l'impasse diagnostique dans les maladies mitochondriales : une approche transcriptomique dans les fibroblastes et les cellules sanguines

Promoteur : Centre Hospitalier Universitaire de Nice

Titre et résumé traduits de l’anglais par le portail, à partir de la fiche publiée par le registre source, le 13 septembre 2026. Traduction automatique, sans relecture médicale : elle ne modifie ni n’interprète le contenu ; en cas de doute, le texte original fait foi.

Texte original (anglais)

Combating the Diagnostic Impasse in Mitochondrial Diseases: a Transcriptomic Approach in Fibroblasts and Blood Cells

Next-generation sequencing (NGS), and in particular whole exome sequencing (WES) or genome sequencing (WGS), has enabled a significant technical advance that has considerably improved genetic diagnostics. However, around 50% of patients still remain undiagnosed and are in diagnostic limbo. One of the causes of this is pathogenic variants that modify transcript expression and/or RNA splicing. These variants may be located in deep intronic or intergenic regions, or in the coding sequence, synonymous or missense variants, also having pathogenic consequences on splicing or gene expression. It is very often difficult to interpret the pathogenicity of these variants, which often remain variants of uncertain significance (VSI). The usefulness of transcriptome sequencing (RNA-seq) in the genetic diagnosis of MM has been demonstrated in recent years by several teams with diagnostic yields of 10% to 35%. These studies are ideally performed using muscle tissue, as MMs are most often expressed in tissues with high energy metabolism such as muscle, heart, brain or liver. However, as biopsies of these tissues are difficult to obtain, most transcript studies are performed using fibroblasts obtained from skin biopsies. Indeed, extreme regulatory defects such as loss of expression or aberrant splicing can be detected in fibroblasts, even though the physiological consequence on fibroblasts may be negligible. However, some patients also refuse these biopsies and may remain in diagnostic limbo in the absence of functional analysis to confirm the pathogenicity of the variants identified. RNA studies can also be performed using RNA extracted from blood cells on PAXGene tubes. The quantity of RNA extracted is lower than that extracted from fibroblasts, but this type of analysis avoids a more invasive procedure, saves technical time by avoiding the manips associated with cell culture, and saves time for the patient by enabling immediate extraction from the blood tube without waiting for cell culture. Frésard et al showed in patients with 16 different Mendelian pathologies that RNA-seq on blood cells identified a diagnosis in 7.5% of patients tested. Their approach revealed both expression variations and splicing anomalies. The investigators therefore propose to carry out a transcript study using high-throughput RNA sequencing (RNA-Seq), in parallel on RNA extracted from fibroblasts and on RNA extracted from blood cells, on 10 patients with suspected mitochondrial disease in whom variants of uncertain significance in candidate genes (VSI+) have been identified. The investigators chose to target our study on patients with VSI+, previously identified by NGS, to facilitate interpretation of the RNA-Seq data within the framework of a "pilot" study. In these patients, who carry variants in candidate genes, the investigators will focus our bioinformatics analysis on these genes. For the interpretation of VSI+, a targeted approach using Sanger sequencing based on RT-PCR, or quantification of gene expression using quantitative PCR, is also feasible, but requires custom development for each variant, which is very time-consuming and not insignificantly expensive. The advantage of an RNA-seq approach is that it homogenizes the diagnostic strategy for patients, saves analysis time and therefore reduces the time spent in diagnostic wandering. Finally, the drastic reduction in the cost of NGS sequencing means that this technique could be used routinely as a complement to exome/genome sequencing. It could therefore eventually be applied not only to patients with VSI+ but also, in the absence of evidence of potentially pathogenic variants, as an aid to filtering variants identified by WES/WGS.

Le séquençage nouvelle génération (NGS), et en particulier le séquençage de l'exome entier (WES) ou du génome entier (WGS), a permis une avancée technique majeure qui a considérablement amélioré le diagnostic génétique. Cependant, environ 50 % des patients restent encore sans diagnostic et se trouvent dans une impasse diagnostique. L'une des causes de cette situation réside dans les variants pathogènes qui modifient l'expression des transcrits et/ou l'épissage de l'ARN. Ces variants peuvent être situés dans des régions introniques profondes ou intergéniques, ou dans la séquence codante, qu'il s'agisse de variants synonymes ou faux-sens, ayant également des conséquences pathogènes sur l'épissage ou l'expression génique. Il est très souvent difficile d'interpréter la pathogénicité de ces variants, qui restent souvent des variants de signification incertaine (VSI). L'utilité du séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans le diagnostic génétique des MM a été démontrée ces dernières années par plusieurs équipes, avec des rendements diagnostiques de 10 % à 35 %. Ces études sont idéalement réalisées à partir de tissu musculaire, les MM s'exprimant le plus souvent dans les tissus à métabolisme énergétique élevé tels que le muscle, le cœur, le cerveau ou le foie. Cependant, les biopsies de ces tissus étant difficiles à obtenir, la plupart des études de transcrits sont réalisées à partir de fibroblastes obtenus par biopsie cutanée. En effet, des anomalies de régulation extrêmes telles qu'une perte d'expression ou un épissage aberrant peuvent être détectées dans les fibroblastes, même si la conséquence physiologique sur les fibroblastes peut être négligeable. Cependant, certains patients refusent également ces biopsies et peuvent rester dans une impasse diagnostique en l'absence d'analyse fonctionnelle permettant de confirmer la pathogénicité des variants identifiés. Des études d'ARN peuvent également être réalisées à partir d'ARN extrait de cellules sanguines sur tubes PAXGene. La quantité d'ARN extraite est plus faible que celle extraite des fibroblastes, mais ce type d'analyse évite une procédure plus invasive, permet de gagner du temps technique en évitant les manipulations associées à la mise en culture cellulaire, et permet de gagner du temps pour le patient en permettant une extraction immédiate à partir du tube sanguin sans attendre la culture cellulaire. Frésard et al. ont montré, chez des patients atteints de 16 pathologies mendéliennes différentes, que le RNA-seq sur cellules sanguines permettait d'identifier un diagnostic chez 7,5 % des patients testés. Leur approche a révélé à la fois des variations d'expression et des anomalies d'épissage. Les investigateurs proposent donc de réaliser une étude des transcrits par séquençage d'ARN à haut débit (RNA-Seq), en parallèle sur l'ARN extrait de fibroblastes et sur l'ARN extrait de cellules sanguines, chez 10 patients présentant une suspicion de maladie mitochondriale chez lesquels des variants de signification incertaine dans des gènes candidats (VSI+) ont été identifiés. Les investigateurs ont choisi de cibler notre étude sur des patients porteurs de VSI+, préalablement identifiés par NGS, afin de faciliter l'interprétation des données de RNA-Seq dans le cadre d'une étude « pilote ». Chez ces patients, porteurs de variants dans des gènes candidats, les investigateurs concentreront notre analyse bio-informatique sur ces gènes. Pour l'interprétation des VSI+, une approche ciblée par séquençage Sanger basée sur la RT-PCR, ou par quantification de l'expression génique par PCR quantitative, est également envisageable, mais nécessite un développement spécifique pour chaque variant, ce qui est très chronophage et non négligeablement coûteux. L'avantage d'une approche par RNA-seq est qu'elle homogénéise la stratégie diagnostique pour les patients, permet de gagner du temps d'analyse et donc de réduire le temps passé en errance diagnostique.

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