Développement d'une nouvelle technique de quantification de l'ADN mitochondrial dans des fibres musculaires isolées

Les maladies mitochondriales (MM) sont les maladies métaboliques les plus fréquentes. En raison de leur grande hétérogénéité clinique et génétique, leur diagnostic repose exclusivement sur l'identification de variants pathogènes dans des gènes nucléaires ou dans l'ADN mitochondrial (ADNmt). Cependant, à ce jour, 50 % des patients atteints restent sans diagnostic définitif. L'avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS) a amélioré le rendement diagnostique, mais de nombreux variants identifiés demeurent de signification incertaine (VSI), empêchant un diagnostic définitif. L'interprétation clinique de ces variants rares nouvellement identifiés représente donc un enjeu majeur.

Dans le contexte des MM, l'un des critères majeurs de pathogénicité d'un variant de l'ADNmt est une bonne corrélation entre le niveau d'hétéroplasmie et l'atteinte tissulaire ou cellulaire. L'hétéroplasmie désigne la coexistence, au sein d'une même cellule ou d'un même tissu, de molécules d'ADNmt mutées et non mutées. Les variants pathogènes de l'ADNmt sont le plus souvent hétéroplasmiques, les tissus les plus atteints présentant une proportion plus élevée d'ADNmt muté. Dans les biopsies musculaires de patients atteints de MM, les fibres musculaires peuvent présenter un déficit enzymatique en cytochrome c oxydase (COX) (fibres COX-négatives), traduisant un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM).

L'analyse en fibre unique permet d'isoler des fibres musculaires par microdissection LASER et d'y quantifier le niveau d'hétéroplasmie d'un variant. La présence d'un niveau élevé d'hétéroplasmie dans les fibres COX-négatives, par opposition aux fibres sans déficit (fibres COX-positives), constitue un argument fort en faveur de la pathogénicité du variant. Dans le cadre de projets antérieurs, nous avons testé deux techniques de quantification des variants (PCR-RFLP et NGS), mais ces méthodes restent trop chronophages ou coûteuses et sont donc difficiles à maintenir en pratique de routine. Cette étude pilote vise à développer une nouvelle méthode de quantification des niveaux d'hétéroplasmie par PCR digitale.

Plus rapide et moins coûteuse, cette approche pourrait simplifier la mise en œuvre technique et réduire les coûts d'analyse, facilitant ainsi son intégration en pratique clinique. Dans un premier temps, une étude de faisabilité débutera par la validation de la PCR digitale sur de l'ADN extrait d'échantillons sanguins de deux patients porteurs de variants pathogènes identifiés lors d'une étude antérieure (AOI 2017 IDRCB : 2017-A00688-45). Cette validation comparera la PCR digitale à la méthode PCR-RFLP pour la quantification de l'hétéroplasmie et évaluera la fiabilité et la reproductibilité de la technique.

Une fois la validation obtenue, la PCR digitale sera testée sur de l'ADN extrait de fibres musculaires microdisséquées provenant des mêmes patients, afin d'évaluer sa faisabilité à l'échelle de la fibre unique, en comparaison avec les résultats de la PCR-RFLP. Si la faisabilité à l'échelle de la fibre unique est confirmée, la méthode sera ensuite testée chez quatre nouveaux patients du Centre de référence des maladies mitochondriales, chez lesquels des variants de signification incertaine ont été identifiés et pour lesquels des biopsies musculaires comportant des fibres COX-négatives sont disponibles. Des prélèvements supplémentaires (sang, urines et écouvillons buccaux) seront recueillis afin d'évaluer les niveaux d'hétéroplasmie dans différents tissus. Si elle est validée, cette technique pourrait être appliquée à un plus grand nombre de patients et intégrée à la stratégie diagnostique des maladies mitochondriales. Par ailleurs, la PCR digitale pourrait également être utilisée pour quantifier le nombre de copies d'ADNmt, un biomarqueur essentiel pour le suivi des patients atteints de MM.