Développement d’un séquençage ARN ciblé pour le diagnostic de la sclérose latérale amyotrophique

Le diagnostic génétique de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) pourrait permettre d’identifier l’origine de la maladie, ouvrant potentiellement la voie à un traitement ciblé/à une thérapie génique pour le patient. Toutefois, de nombreuses formes familiales de SLA restent génétiquement non diagnostiquées, soit parce qu’aucun variant n’a été détecté dans les gènes d’intérêt, soit parce que le ou les variants détectés sont de signification incertaine.

Actuellement, le diagnostic moléculaire se déroule en deux étapes : 1) recherche de l’expansion GGGGCC dans le gène C9ORF72 par RP-PCR ; 2) analyse des régions codantes par séquençage à haut débit d’un panel de 30 gènes impliqués dans la SLA. Nombre de ces variants de signification incertaine affectent l’épissage. Leur impact peut être prédit à l’aide d’outils in silico, mais seule une analyse de l’ARN du patient peut confirmer leur caractère pathogène.

Actuellement, l’analyse des transcrits n’est réalisée qu’a posteriori, lorsqu’un variant prédit comme ayant un impact sur l’épissage est détecté dans l’ADN du patient. Une RT-PCR suivie d’un séquençage Sanger permet alors de vérifier l’impact des variants d’épissage. Cette méthode a confirmé l’impact de certains variants d’épissage chez des patients. Cependant, cette méthode est chronophage, nécessite un développement sur mesure, et dépend de la mutation, du gène et du patient concernés.

À l’inverse, le séquençage ARN à haut débit (RNA-Seq) permet d’analyser simultanément l’épissage de nombreux gènes, selon une approche globale, applicable à tous les patients. Cette approche évite la conception sur mesure d’amorces, qui peut être biaisée par l’interprétation des prédictions d’épissage, tandis que le RNA-Seq capture et séquence systématiquement l’ensemble des transcrits. Enfin, le RNA-Seq fournit des informations supplémentaires par rapport au séquençage de l’ADN, telles que la détection de l’exclusion d’exons, de l’inclusion d’introns et la formation de transcrits de fusion.

Dans le cadre du projet GTEx (GTEx Consortium, 2013), les niveaux d’expression des transcrits du génome humain ont été quantifiés par RNA-Seq. À partir de ces résultats, les investigateurs de l’étude ont mesuré l’expression des transcrits des gènes connus de la SLA dans le sang total. En appliquant un seuil de 0,5 transcrit par million de lectures (TPM), 25 des 30 gènes de la SLA actuellement analysés par NGS en diagnostic de routine au CHU de Nîmes pourraient être éligibles à une analyse complète par RNA-Seq. Aucun des laboratoires français réalisant des analyses génétiques de la SLA n’a encore développé le RNA-Seq comme outil de diagnostic de routine. Le laboratoire de l’étude reçoit plus de 600 demandes de diagnostic génétique de patients atteints de SLA par an. L’objectif de cette étude est donc de développer une méthode globale d’analyse des transcrits d’ARN des gènes de la SLA afin de catégoriser les mutations et d’améliorer la prise en charge diagnostique des patients.